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检测设备与试剂
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马铃?薯纺锤块茎类病毒核酸斑点杂交检测试剂盒

点击次数:2478 更新时间:2011-6-7 上午 10:58:15

黑农科

马铃薯纺锤块茎类病毒核酸斑点杂交检测试剂盒

显色法

使用说明书

 

黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所

 

  【规格】4T,共96个点样格

  【检测原理】利用*********标记技术,标记了高效、灵敏的类病毒双体探针,利用核酸互补原理使标记的探针与类病毒RNA杂交,经放射自显影或颜色反应检测标记信号,据此判断检测结果。

  【应用领域】马铃薯纺锤块茎类病毒检测

  【有效期】12个月

  【组成及保存条件】

编号

试剂盒组成

体积/数量

保存条件

1

尼龙膜

24/×4

室温

2

杂交袋

5

室温

3

杂交液

25 ml

室温

4

夹膜纸

5

室温

5

检测缓冲液

20 ml

室温

6

试剂

100 ml

室温

7

试剂

20 ml

室温

8

试剂

干粉,可配200 ml

室温

9

试剂

4 ml

室温

10

洗涤缓冲液

干粉,可配500 ml

室温

11

提取缓冲液

100 mL

室温

12

阳性对照

0.1 g

室温,干燥

13

阴性对照

0.1 g

室温,干燥

14

Dig-AP酶结合物

10 μl

4

15

NBT

20 μl

4,避光

16

BCIP

20 μl

4℃,避光

17

探针

8 μl

-20℃

18

10×阻断液

10 ml

-20℃

  注:氯仿(三氯甲烷)需自备

  1准备工作

  1.1 洗涤液Ⅰ:16 ml试剂Ⅰ+1.6 ml试剂Ⅱ,加入142.4 ml无菌蒸馏水,混匀,即为洗涤液Ⅰ工作液,或按照此比例吸取适量的溶液配制工作液。

  1.2 洗涤液Ⅱ:800 μl试剂Ⅰ+1.6 ml试剂Ⅱ,加入157.6 ml无菌蒸馏水,混匀,即为洗涤液Ⅱ工作液,或按照此比例吸取适量的溶液配制工作液。

  1.3 试剂Ⅲ:用160 ml蒸馏水充分溶解试剂Ⅲ干粉,用固体NaOH调节pH至7.5,定容至200 ml,此溶液可长期保存,因为每个试剂盒只有一份,请保留此溶液,以备下次使用。

  1.4 洗涤缓冲液:将洗涤缓冲液干粉溶于400 ml无菌蒸馏水中,用固体NaOH调节pH至7.5,加入试剂Ⅳ 1.5 ml,定容至500 ml即为洗涤缓冲液工作液,注意将瓶内药品冲洗干净,以免降低工作液浓度。此溶液可长期保存,因为每个试剂盒只有一份,请保留此溶液,以备下次使用。

  2 操作步骤

  2.1类病毒样品RNA的提取

  称取0.2 g样品,放入研样袋或研钵中,加入提取缓冲液0.3 ml,充分研磨,混匀,转入离心管中,盖严,37℃孵育15 min,之后加入0.3 ml三氯甲烷(氯仿,自备),振荡,使之彻底混匀,直至出现乳状液,10,000 rpm,离心5 min,至溶液分离 (或把离心管放在4℃冰箱过夜,分离RNA),吸出上清液即为RNA样品,4℃(短期)或-20℃(长期)保存,备用。

  注:此处阴阳对照各取0.02 g样品,分别加入提取缓冲液0.5 ml,其他操作与受检样品完全一致。

  2.2 点样、固定

  吸取制备的样品及阴阳对照RNA提取液2 μl(2.1), 点在尼龙膜的方块格中,详细记录点样位置,样品点在尼龙膜的光滑面上,左上角的切口作为起始点标记。将点样后的膜放在紫外交联仪上正反面各交联1 min,能量为1200;若没有紫外交联仪则先80℃烘干10 min,再用紫外灯正反面各照射5-10 min。(注:用超净工作台的紫外灯即可,注意使尼龙膜与紫外灯的距离在10 cm以内)。

  2.3 杂交

  2.3.1 将探针加入到4~5 ml杂交液中(1~2 μl/膜),混匀,转入相应容器中(注:杂交箱使用杂交管;水浴震荡培养箱使用杂交袋;震荡培养箱使用三角瓶)。

  2.3.2 将固定后的膜放入混有探针的杂交液中,排尽气泡。

  2.3.3 杂交

  方法一:若使用杂交箱,8~15 rpm,68℃杂交过夜;

  方法二:若使用水浴震荡培养箱,则把杂交液倒入杂交袋中,排除气泡,封口,震荡培养,80~100 rpm, 68℃,杂交过夜;

  方法三:若使用恒温或全温震荡培养箱,则把尼龙膜放入三角瓶中,68℃杂交过夜,若达不到68℃,则在该培养箱的******温度下杂交过夜。

  2.4 洗膜

  2.4.1杂交过夜后,用镊子取出膜,放入装有20 ml洗涤液Ⅰ(1.1)的平皿中,在室温下振荡洗涤2次,每次5分钟。(也可以在杂交管中用******转速进行洗涤)

  2.4.2 55℃预热洗涤液Ⅱ溶液(1.2),用镊子将膜转入5 ml该溶液中(溶液充分覆盖尼龙膜),55℃振荡洗涤2次,每次15 min。(也可以在杂交管中用最大转速进行洗涤)

  2.4.3 用镊子将膜取出转入装有20 ml洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5 min。

  2.5 信号检测

  注意:所有孵育过程应在15-25℃下搅拌进行。

  2.5.1 在20 ml阻断液中孵育30 min。

  注:2 ml 10×阻断液+18 ml试剂Ⅲ(1.3)即为20 ml阻断液工作液。

  2.5.2 阻断后,吸取上述用过的阻断液10 ml,在其中加入抗Dig-AP酶结合物2 μl,混匀,即为抗体液(可以根据所检测样品多少适当调整,10 ml/膜足够),将尼龙膜放入此抗体液中,孵育30 min。

  注:抗Dig-AP酶结合物在每次使用前,需要10,000 rpm离心5 min, 从表面小心吸取所需溶液,用阻断液按1:5000稀释抗体液。

  2.5.3 在20 ml洗涤缓冲液中洗涤2次,每次15 min;

  2.5.4 在约20 ml检测缓冲液中平衡2~5分钟。(注:4 ml 5×检测缓冲液+16 ml 无菌蒸馏水,此处预留出适量检测缓冲液工作液,下一步配制显色液使用);

  2.5.5 将膜夹在两层夹膜纸中间,将上层膜提起,在尼龙膜上均匀地涂上适量显色液,然后缓慢放下上层保鲜膜,使底物均匀的覆盖尼龙膜表面,排除气泡。

  注:显色液配方:1μl NBT + 1μl BCIP +100 μl 检测缓冲液工作液,约200 μl~300 μl /膜,使用时根据检测膜的多少按照此比例适量配制,现用现配。

  2.5.6 将膜夹在平整的书或暗盒内,避光条件下进行显色反应,当达到所需的点强度后(大约20~30分钟)进行结果判读,拍照或扫描保存检测结果。

  注:点样格显示为蓝紫色斑点者为马铃薯纺锤块茎类病毒阳性样品。如下图,其中蓝紫色斑点对应的样品为马铃薯纺锤块茎类病毒阳性样品。

  3 注意事项

  3.1 请严格按照说明保存药品。

  3.2 杂交过程中,若杂交温度没有达到68℃,则实验的灵敏度会有所降低。

  3.3 提取缓冲液在温度较低的情况下容易浑浊,请摇匀后使用。

 

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